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          蛋白质组学和代谢组学 定量蛋白质组学 Label Free

          Label Free 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

                非标记定量技术(Label Free)用来比较的样品不经过任何标记,直接酶解后经过质谱分析产生数据。通过软件对谱图进行归一化后,比较对应的质谱峰的强度,峰面积等一系列因素,来确定蛋白质在几组样本中的相对表达量变化。Label Free技术减少了前处理过程中的样品损失,在肽段的检测和蛋白质覆盖率方面具有优势;其采用单个样品单独分析,不受样品来源和数目的限制;并且该技术方便与蛋白质绝对定量技术相结合,对生物体系中表达蛋白质绝对含量进行测定。

          实验流程


          技术平台   

                 Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion Tribrid
          技术优势

            蛋白质不需要进行标记,所需样品总量少,耗费低

          应用领域

            机理和调控机制研究 

            疾病标志物的筛选

            用药及预后标志物筛选

            疾病的分子分型



          生信分析

              

          送样要求

          样品类型

          样品要求(/组样品)

          备注

          蛋白质溶液

          蛋白质总量≥300µg

          重复实验则量翻倍,建议准备两份样品备用。

          组织样品

          样品总量≥0.1g

          按照蛋白质组织提取效率(蛋白:组织=7%

          细胞样品

          细胞数量≥107

          胰酶消化,按细胞冻存标准离心收集细胞即可。

          体液样品

          血清≥200µL,脑脊液≥200µL,尿液≥1mL ,泪液≥1mL.

           



          案例:直肠癌蛋白质组学分型

                    通过分析95例大肠蛋白质组,一共鉴定到 7526个蛋白质(FDR<2.64%)。基于鉴定到的蛋白质相对定量信息,将本来通过基因型分为3个型的95例样品,更加细分为5个亚型,其中一个具有不良的预后,这样更加有利于精准医疗的参考。

          参考文献:

                Zhang, B., et al. (2014) Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature 513, 382-387.


          1、 Label Free原理是什么?

             无标签标记的定量蛋白质组学研究,依赖于繁杂的信息分析完成定量过程,主要有两种:信号强度和谱图计数法。前者根据一级质谱相关的肽段峰强度(Mass spectral peak intensity)、峰面积(Peak area)、液相色谱保留时间(LC retention time)等信息进行定量分析;后者根据二级质谱相关的每个蛋白鉴定到的肽段总次数(Peptide hide或Spectral counts)、所鉴定肽段的离子价位(Ion counts of identified peptides)等信息进行定量分析。


          2、 Label Free有哪些技术特点?

               对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高;无需昂贵的同位素标签作内部标准,实验耗费低;对样本的操作也最少,从而使其最接近原始状态,并且不受样品条件的限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。


          3、iTRAQ和Label Free各有哪些优缺点?

              iTRAQ

              优点:1. 不受样品来源制约,几乎可对各种样品进行标记;2.通量高,可同时标记 2-8 个样本;3.可信度高.标记试剂的报告离子的相对分子质量较低,质谱在低分子量区的定性和定量较为准确;4.可进行翻译后修饰分析。

              缺点:1.iTRAQ几乎可以与样品中的所有蛋白质相结合,容易受到污染蛋白的影响;2.试剂昂贵,操作繁琐。

               Lable Free

              优点:1.样品需求量低;2.操作简便,不受样品的来源与通道数目的限制;3.单次实验可鉴定和定量更多的蛋白质。

              缺点:1.在提取离子信号强度之前,需要对原始数据进行预处理,比较复杂;2. 准确性低,依赖质谱稳定性,在蛋白丰度差距较大时,无标的区分效率较好。

             




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