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          创富彩票平台助力客户登陆《柳叶刀》

          项目文章2016-10-20 17:53

            华南农业大学刘健华教授团队和中国农业大学徐沈建忠教授团队合作在国际权威医学期刊《柳叶刀》子刊《柳叶刀·传染病》(Lancet Infect Dis,IF:22)上发表题为 “Emergence of plasmid-mediated  colistin  resistance  mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and   molecular biological study”的研究文章,相关测序工作由创富彩票平台携手完成。

          研究背景

            迄今为止,已发现的多粘菌素耐药性都与细菌基因组的突变有关,未报道其与可移动遗传元件有关。在我国开展的一项食用肉畜中共生大肠杆菌的耐药性常规监测项目中发现,细菌对多粘菌素的抗性显著增加。研究人员发现猪体内分离的大肠杆菌SHP45,其多粘菌素耐药性可以传递给其它菌株,通过对该菌株的质粒测序首次发现了质粒介导的MCR-1多粘菌素抗性机理。

          研究方法

            通过全质粒测序和亚克隆发现MCR-1基因;利用序列比对、同源建模和电离质谱对MCR-1的分子机理进行了分析和研究;对2011年4月至2014年11月收集的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的MCR-1基因进行了分子流行病学调查;用小鼠模型研究了MCR-1与多粘菌素的耐药机理。

          分析内容

            pHNSHP45转移机制研究和药物敏感性试验

          对pHNSHP45质粒的转移机制研究发现,它可以通过接合机制,以10-1-10-3的转移率转移进其他大肠杆菌中。pHNSHP45能通过转化(不能接合)进入大肠杆菌E11(ST131),肺炎克雷伯菌MPC11,肺炎克雷伯1202(ST11)和铜绿假单胞菌FE26,表现出高达8-16倍的最小抑制浓度。大肠杆菌W3110转导子质粒pUC18-MCR-1包含一段1949bp的pHNSHP45序列片段,也表现出高达四倍的最小抑制浓度。这些表明MCR-1存在使宿主菌种产生了多菌素抗性。

          质粒测序与质粒介导的多粘菌素抗性因子证实

            对质粒pHNSHP45测序得到其基因组小大为64015bp,GC含量43%,预测到60个基因。属于典型的IncI2型质粒。其中在一个IS序列的下游区域,发现有一个1626bp的ORF,命名为MCR-1,GC含量为49%(图1)。



          图1 质粒pHNSHP45圈图

            将mcr-1基因克隆到pUC18质粒,用其转化大肠杆菌W3110发现,W3110对多粘菌素产生抗性。随后对MCR-1基因在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌中的存在情况进行了检测,选取从2011年4月份到2014年11月份之间,来自我国五个不同省份的检测样本,发现从动物体内以及市场上零售的肉类食品中分离出的大肠杆菌样本有高比例的MCR-1基因存在(表1)。

          表1 多菌素抗性基因MCR-1流行情况



          同源蛋白建模分析

            对MCR-1蛋白质序列的初步分析发现在其N端的200个氨基酸序列具有五个亲水性跨膜α螺旋。蛋白质同源建模发现两个已知蛋白结构的磷酸乙醇胺转移酶(LptA:源于脑膜炎奈瑟氏球菌;EptC:源于空肠弯曲菌)的可溶性部分与MCR-1有同源性。建模结果显示其N端结构与LptA、EptC其中之一吻合,C端折叠与两者高度吻合。序列对比分析发现MCR-1具有在LptA和EptC中起催化活性的关键残基。因此,MCR-1的序列和结构预测证明其是一个膜锚定的具有磷酸乙醇胺转移酶活性的蛋白。



                               图2 MCR-1的N末端结构与同源建模

          MCR-1对多粘菌素抗性的活体分析

            将含有MCR-1基因的大肠杆菌363R与消除MCR-1的363S分别导入小鼠模型,结果发现在106菌落单位中,72小时内363S的传递至少减少三个数量级,而363R仅减少一个数量级。这表明在体内MCR-1的存在能够使细菌产生多粘菌素抗性。



                                 图3 体内感染实验

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